徐州电泳公司地址 请问什么是活性的超氧化物歧化酶,人工是如何制造出...

超氧化物歧化酶(SOD) 超滤法生产新工艺

前 言

SOD的中文名称是超氧化物歧化酶，其英文名为Superoxide dimutase，分子量(牛血红细胞) 约 32000 是广泛存在生物体内的金属蛋白醇 ， 别名有 ： orgotein，ormetein，ontosein； Cu.Zn-SOD；Palosein等，SOD被科学家誉为21世纪最有发展前途的药用酶。

一、本工艺是从红细胞，肝和其它哺乳动物组织分离而得的金属酶；含两个亚基，每个亚基各含一个铜原子和一个锌原子，SOD可催化O2，歧化为H2O和O2， 其性质不仅仅取决于酶蛋白，而且还取决于活性部位的金属离子，按金属离子类型不同， 可分为Cu.Zn--SOD和Fe--SOD，Mn--SOD三种.在一般条件下，SOD较稳定. 不同来源的 Cu.Zn--SOD，其紫外吸收光谱略有差异，如牛血SOD在258nm处显示最大吸收，而猪血SOD的最大吸收峰为265nm，在特定条件下，酶的活性可下降，甚至完全丧失， 如氰化物可抑制SOD活性，双氧水使SOD活性下降，氯化胍能明显抑制SOD活性等。

二、SOD用途主要是基于SOD是超氧阴离子清除剂，超氧阴离子(O2~)是人体内有毒物质，它能引起多种疾病，故能清除炎症过程中伴同产生的超氧离子， 而显示出强大的抗炎作用。

在医药工业：SOD可以治疗由于超氧离子引起的各种疾病，如糖尿病，白内障， 风湿性关节炎等，也是消炎的有效药物，而且还能抗衰老，抗肿瘤，抗辐射， 抗自身免疫疾病，现代研究表明：SOD还能治高血压，冠心病，胆囊炎，肺气肿等难治之症. 日用化学工业：由于SOD有防止细胞老化和解毒等功效， 因此在化妆品和护肤剂等工业产品中，添加SOD之后，具有防晒，祛斑，使皮肤柔嫩的作用.是目前化妆品行业中不可缺少的一种添加剂，国内及同行都已出现大量产品.食品工业：在食品添加剂加 SOD之后，增强营养，解除毒性，延长体内细胞寿命，国内已有SOD营养液产品， 并通过上海科研单位有关专家的鉴定。

三、SOD的开发前景：目前SOD在全国仅有少数科研单位及生化制药厂研究和开发本产品，而使用SOD产品厂家却日益增多，远不能满足市场需求 . 为鼓励和大力开发SOD新产品，国家已将其列入重点科技开发项目，并投放大批经费，现已获得成功， 开始向企业化生产转移，市场前景十分广阔。

四、注意事项：(1)我中心热忱欢迎社会各界朋友现场学习，由生化工程师向您授课，通过现场操作，指导，培训，使您尽快掌握该技术。(2)本工艺， 技术资料等不经我公司同意，不得擅自转让，翻印，*给任何单位和个人，违者法律追究。

新法提炼技术

一、主要设备：(1)工业用离心机一台；(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可*)1台；(3)冰柜1台；(4)搅拌机1台；(5)玻璃器皿：1000ml，500ml烧杯各3只，50ml烧杯 2 只，50ml，500ml量杯各1个；(6)塑料桶若干个。

二、主要试剂：(工业纯度)柠檬酸钠，柠檬酸，葡萄糖，乙醇90%，氯仿，丙酮，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，去离子水或蒸馏水，葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.

三、试剂的配制：

1.抗凝剂配方：(1)柠檬酸钠30g，柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升，一般此种是每7ml血液，加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液：在1升水中加入0.9克的氯化钠。

2.生理盐水：(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠。

3.磷酸盐缓冲溶液的配制：PH7.6，0.2M磷酸盐缓冲溶液，一般用Na2HPO4.H2O，35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升，前者加87.0ml，后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液，如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升，NaH2PO4.2H2O为31.21克/升，仍是前者87.0ml，后者13.0ml混合后即得。

4.冷却剂：在本工艺中有使用-15度低温，一般用如下配方：用33克食盐加入100克雪或碎冰，以此比例配成混合体可达-21.3度。

四、工艺流程

(一)除血红蛋白

1.血液抗凝处理，在新鲜牛、马、猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂，并缓慢搅匀，每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂。

2.把抗凝处理的血液放入离心机，以3000r/min离心约15--20分钟， 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉，下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次，在每一次洗涤中，用离心机以3000r/min离心，7--8分钟，反复操作后，得到洗涤血红细胞，洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活，在血液量大， 处理不完时必须这样做。

3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30分钟，使红血球细胞壁砍碎，以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后，把溶血进行有机提取。

4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿，搅拌10--15分钟后，原溶血呈浆糊状，静止1--2小时，用滤布除去凝固的血红蛋白，然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀， 此时如果上清液略为微黄色时，可用快速过滤纸过滤，可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液。

(二)粗酶液的初步提纯：

1.丙酮提醇：向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 ， 生成大量白色沉淀 ， 以3000r/min离心2分钟收集沉淀，上清液可不必吸取，直接倾倒。

2.热变性：(除杂蛋白)准备好衡温浴锅，在本工艺中，提前30分钟， 注满水接通电源后，使之加热到55--60度以省时间，将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液，水浴加热至60度，15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液，在上清液中，缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮，生成白色沉淀。

3.初纯SOD：在上述沉淀中加去离子水，制成20--30%SOD溶液，分装入样品瓶中，放入冷冻干燥机中，于开机后以0.2--0.1Torr真空度，约1.5--2小时， 得到化妆或食品用SOD，该产品比活大于3000u/mg，外观呈微带蓝色的白色冻干品。

(三)SOD进一步提纯：

SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析，柱层析后的SOD没有小分子等杂质， 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高，它主要作为生物化学试剂， 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种，二者可单独使用，也可结合使用，一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析，将(二)2，热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6，0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解，有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀，上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm)，梯度洗脱 ， 洗脱液为PH7.6，0.2M，NaH2PO4--NaHPO4缓冲液，下流速度控制在0.2--0.5ml/min，在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液，合并活力峰，再用蒸馏水反复透析，透析彻底后， 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品。

五、注意事项：

1.掌握适当的温度和时间：虽然SOD对热较稳定， 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度，一般以0--10度为宜，时间长不要超过3天。

2.注意提取，提纯方法：使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质， 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果。

六、SOD的检测方法：活性检验，比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法， 先测得连笨三酚的自氧化速率，然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率，按照酶活性单位定义，即在最佳条件下，每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ，同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度，看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.

超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。

自1969年Mccord和Fridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，1988年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。

SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过20种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。

我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。

本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为CuZu-SOD。

一、药品与仪器：

(1)柠檬酸三钠：Na3C6H6O7 (2)工业丙酮CaH6O

(3)邻苯本酚 (4)酸磷钾K3Poe4

(5)弱碱性阴离子交换剂DEAE Sephadsxa-50外观40-120ubrd或者DEAE-cell-ujose(DE-32)二乙基纤维素。 (6)冷冻干燥器(自己组配)

(7)层折柱(7.5＊30cm) (8)离心机

以上试剂及其它药剂、仪器可在各省市化学试剂商店、医疗器械商店购*。

二、Cu、Zu-SOD的提取及纯化(牛、马血为例)

1、工业流程：

加抗凝剂 盐洗

鲜牛血--------------------->红血球------------------------>

离心除黄色血浆 加NaCL

热变性1 热变性2

压积红细胞-------------->淡黄色混合液--------------------->

68度30分钟 60-65度20分钟

加丙酮 加丙酮 层析

浅蓝色清液----------->絮状沉淀-------------->沉淀------------>

冻干

透析除盐

洗脱----------------->透析液--------->SOD(冻干品)

2、提取方法

(1)收集红细胞：鲜牛血100升，加入3. 8％柠檬酸三钠抗凝剂搅拌均匀，静置，使红细胞自然沉降，除去上层大部分血浆，下层液再离心除尽其余血浆，再加入3倍量0.9％氯化钠(精制食盐)洗涤两次， 离心可收集到压积红细胞(40升)。

(2)热变性1：收集的红细胞再加入4公斤氯化钠，40克氯化铜，蒸馏水100升搅匀，水浴加热到68度恒温30分钟，迅速冷却加至室温，过滤除沉淀，收集滤液。

(3)热变性2：滤液在65度恒温水浴下，向滤液中慢慢中入40克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温20分钟，迅速冷却至室温，离心去沉淀得上清液。

(4)SOD粗品：超滤心清液加入0.75倍全积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀于离于水，离心除去不溶物得清液，清液加入0.75倍体积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀，沉淀经无水丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得淡蓝色粉末状SOD粗品

(5)SOD粗品提纯：SOD粗品溶于2.5mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液，将该混合液上在7.5＊30cm的层柱上，离子换剂为DEAE-SphadexA-50(该柱事先用缓冲平衡)，以100～200ml/小时速度上样，完毕后用同一缓冲A280mm值，低于0.02然后用25～200mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液进行直线梯度分段洗脱，流速为100ml/小时。用部分收集器收集， 洗脱液经透析除盐后，得浓缩的透析液，经冷冻干燥，得SOD成品，(呈浅绿色)。

三、SOD活性测定：

SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。

1、试剂及仪器

(1)邻苯本酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。

(2)UV－754紫外分光光度计。

2、测定方法：

(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。

在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。

(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：

测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。

0.0700－A325mm/min

----------------------------------------＊100％度

0.70

样液稀释倍数 样液稀释倍数

酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------

50％ 样液体积

3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：

SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。

4、比活(u/mg蛋白)的计算：

单位活力(u/ml) 总活力

比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白

蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白

四、Cu、Zn－SOD性质：

1、Cu、Z n－SOD呈蓝绿色，分子量在3200左右，由两个中一个Cu和一个Zn。

2、对热稳定，天然牛血SOD，75度下加热数分钟其酶活丧失很小。

3、PH值对SOD的影响，SOD在PH5.3～10.5范围内，其催化速度不受影响，PH3.6时SODZn脱落95％，PH12SOD构象发生不可递的构象，导致酶活性丧失。

4、SOD的紫外线吸收特征：SOD在280mm处没有吸收高峰。

5、金属辅其与酶活性。SOD属金属酶Zn仅于分子结构有关，而Cu与催化活性有关。

6、SOD是其具有还有和失活作用的。

五、药品与仪器：

柠檬三钠，分析纯：江苏花桥北工四厂；

工业丙酮：上海溶剂厂；

邻苯三酚，分析纯：贵州遵义化工厂；

六、SOD的包销单位：

(1)河南郑州国营圣科研究所郑州南阳路14号 邮编：450053《河南科技报》91年10月3日

(2)四川省金堂县工艺制品技校生化科接待室：金堂准口执行的院内，*办公大楼1楼 邮编：610404 联系人：邓勇 彭丽 《四川农村报》 91年3月1日

(3)广东省深圳市上步区石夏东二苍14号科技所 邮编：518031联系人：黄秋林 《科技消息报》92年7月10日

说明：1、资料后附的产品*地址信息均为我们从近两年的报刊上摘录的各单位广告，并注明有出处。

2、你先看完资料后，行根据自己的实际情况，先小量试验， 并事先联系好产品的*单位，待取得经验后再批量生产。

3、读者在联系*单位时，请一定事先去联系，并附上邮资， 待得到明确答复后再根据情况去人办理，千万不要冒然前往，以免造成不必要的经济负担。

4、原料及仪器各地经营原料店供应，广州市人民南路，上九路等地均有供应。

附：详细SOD*信息

1、广西南宁市生物化学制药厂

地址：鲁班路1号

2、上海生物化学制药厂

地址：海主路513号

3、江苏徐州市生物化学药厂

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4、山东兖州市生物化学制药厂

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9、哈尔滨生化药厂哈肉联厂

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通讯：北京市石景山区40-021信箱

邮编：100040

简介：江苏金彭车业有限公司是一家通过ISO国际质量管理体系认证的大型高科技民营企业。公司集三轮电动车、三轮摩托车、四轮电动车及部分特种车辆的研发、*、*与一体。江苏金彭车业有限公司成立于2004年，现已建设完成了江苏、河北、河南、四川、新疆、广西6大生产基地的全国布局，并下设6大中心及5大事业部。集团总占地面积近2000亩，生产厂房面积80万平方米，设计年产能200万台。集团建有多栋大型现代化厂房和物流配送中心；拥有汽车工艺级的阴极电泳涂装线、无尘高温烤漆线；以及整机装配、焊接磷化、材料加工等20多条现代化生产作业流水线；并且公司引进了40台国际领先的进口OTC焊接机器人，使公司的*装备水平得到提高。“真金品质，彭程万里”。
法定代表人：鹿守光
成立时间：2009-07-20
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山东四季福新能源车业有限公司（原宏光电动车厂）是一家集生产、*为一体的电动三轮车生产厂家。主要生产东风系列、金刚系列电动三轮车，后开斗电动车，三开斗电动车、环卫车、果园专用车等。经过十几年不断的努力，已发展成为电动三路车*厂家，具备开发能力和生产能力，有力保障了市场投放。

参考资料：

山东潍坊益强电动车厂-公司介绍

沛县伟达电动车*厂-公司介绍

香河强胜电动车*有限公司-强胜简介

安徽锦环电动科技有限公司-公司简介

江苏安迪泰机车*有限公司-关于我们

山东四季福新能源车业有限公司-公司介绍