单细胞测序试剂品牌排行榜 实用干货|单细胞测序组织保存液那些事

单细胞（single cell）分选平迹坦世台比较（10X Genomics，BD Rhapsody，Fluidigm C1）

那么问题就来了：

从上图中我们可以看到，2010年-2014年之间，单细胞测序领域采用的主流技术的细胞通量都在100以内，哪怕是最为先进的Fluidigm C1平台也是如此。因此我们在2014-2016年间看到的大量Single-Cell Seq的高分文章的单个细胞测序数量一般都在1000以内，因为这1000个细胞代价极大。

Fluidigm C1平台，是最早被应用于Single Cell领域的商业化分选技术，基于富鲁达（Fluidigm®）的微流控技术，大约在几个小时中可以捕获96个左右的细胞，进行各类的Single-Cell测序建库。当然，通量还是比较小。但不可否认的是，现在很多非RNA类Single Cell测序，仍然在采用这样的技术，如Single Cell DNA-Seq，Single Cell ATAC-Seq等，都是采用此技术进行单细胞分选后再分别用不同试剂盒建库。所以可以说，至少在10X和BD，或者其他企业推出有效的Single DNA测序技术之前，C1仍然会是市场上的重要组成部分。

令人亢奋的是，在2014-2015年间几个**性技术诞生了，仿佛寒姿肢武纪大爆发一般，MARS-Seq、CytoSeq、Drop-Seq、inDrop技术在这两年中扎堆出现，真正引爆了Single-Cell这个领域。而在2017-2018年，商业化的测序平台（10X Genomics®, BD Rhapsody®），逐渐浮出水面，才最终让Single-Cell测序技术走进了民用市场。

10X Genomics

BD Rhapsody

从成本上来说，基于C1类的捕获技术的代价非常大，单细胞捕获成本在9-30美元不等，而且这还是一个没有关税、没有代理商加价的价格。2000-3000细胞需要18000-100000美元不等的捕获费用，可以说非壕不可用的技术。因此暂时就不做详细讲解了。

Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative *ysis of single-cell RNA sequencing methods[J]. Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643. e4.

主要讲讲两个现在的主流技术，BD Rhapsody以及10X Genomics。从诞生年代来看，两者不分伯仲，10X Genomics起源自Drop-Seq技术，得益于哈佛大学的研究所的工作。

从Drop-Seq技术到10X Genomics技术

BD的Rhapsody平台，最早可以追溯到2015年Single Cell Cytoseq技术，可以说是完全同时代的技术。2017年BD也携一篇研究脑神经的Nature Article将该商业化技术发布了。（Birey F, Andersen J, Makinson C D, et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids[J]. Nature, 2017, 545(7652): 54.）

10X Genomics和Drop-Seq具有类似的技术原理。从横向孔道中逐一输入凝胶微珠，第一纵向孔道输入细胞，凝胶微珠与细胞碰撞后会吸附在凝胶微珠上，并通过微流控技术，将之输入到第二信岁纵向孔道，即油相孔道中。这时候，就形成了一个个油滴，最终输出并收集在EP管中。每一个油滴中会落入一个细胞以及一个凝胶微珠，那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，构成我们的捕获凝胶微珠。而这个凝胶微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。

10X Genomics凝胶微珠设计

所以一个油滴=一个单细胞=一个凝胶微珠=一个RNA-Seq，可以说这就是10X的基本技术原理。

然而市场并不只有一家Single Cell的商业化捕获平台，另外还有BD这个老牌的抗体巨头的Rhapsody平台。这个平台又是依托什么技术，和10X Genomics技术存在什么区别呢？

BD的技术不再采用利用微流控孔道射出细胞和射出的磁珠碰撞的过程，进行单细胞捕获的技术，转而采用CytoSeq特有的蜂窝板技术。该技术用20W+的微孔（该数量级远大于Input细胞数量），保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了10X中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题，采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率（来自两家企业商业宣传资料比对），保证Input细胞的全面使用。对于Input细胞的量更少的情况，可以基于10E5的细胞总量开始进行前期处理以及后期捕获操作。（烈小冰在之前的实验技术分享里提到过 Single Cell前处理会丢失一些细胞哦！） 而在细胞捕获完成后，进行细胞裂解后，同样的也进行细胞中RNA polyA序列的抓取工作。

BD Rhapsody 单细胞mRNA抓取过程

所以一个微孔=一个单细胞=一个磁珠=一个RNA-Seq，可以说这就是BD的基本技术原理。

从现有数据来看，我们很难比较两种技术的优劣，但是从现有的文章发表情况来看，两种技术都在主流高IF期刊上有可信的数据发表，并且都与Smart-Seq数据的结果存在比较，因此两种技术都是可用可信的大规模Single Cell RNA-Seq技术。从发布时间来看，10X发布更早，而BD发布在其1年之后，这点上10X Genomics的设备稍占优势。而在捕获效率和有效性来看，BD Rhapsody的捕获效率更高较占优势。

从技术原理上分析两种Single Cell测序技术，都是基于UMI（Unique Molecular Identifier）+ CL（Cell Label）的技术，与传统Smart-Seq + Fluidigm的C1技术比较起来，引入UMI技术（这个我们会在分析部分简单介绍）进行表达定量，使得大规模scRNA-Seq的基因表达定量结果几乎不会受到PCR Bias影响，从而更精确。

图注：如果一个基因具有序列一致的UMI序列的测序Reads，那么这条Reads其实PCR Bias

Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative *ysis of single-cell RNA sequencing methods[J]. Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643. e4.

众所周知，为了保证细胞悬液的质量，单细胞测序对样本新鲜度要求极高，如果采样后无法立即进行细胞悬液制备，如需要运输，或需要暂存与后续样本同批实验等，就需要对样本进行合适条件的保存/运输，否则可能无法保证样本最原始组织细胞状态，对后续结果产生一定影响。目前常用的方式是采用组织保存液储存组织样本，既可以保持样本最原始组织活性状态，又可以解决样本难以获取以及批次性效应等问题。

1.少数样本上门实验性价比不高

如果单次实验样本数较少时选择上门实验，会使无效费用比例增加，进而导致上门实验性价比较低，该情况下，如果能够进行样本邮寄，既可提高效率又可降低费用。

2.不同时间段取样

由于特定取样安排或不同时间梯度设计等原因，如不同患者同类型样本不同时间手术取样，再如小鼠模型6h、8h、12h、18h、24h梯度取样。同一类型样本进行单细胞实验，尽量所有样本收集后同时处理，这样可减少批间差、人为误差、试剂误差等，因闹弊此，该情况最好能脊茄临时保存样本。

3.其他需要样本临时保存的情况

遇到手术时间不确定，难以提前预约准确取样时间，无法正常安排上门樱弯察实验；取样后需要等待一段时间进行病理诊断选择样本取舍；没有合适的场地进行单细胞悬液制备等。

美天旎组织保存液适用于多个时间点采样/不能及时处理样本时48h内的组织保存，不仅细胞得率高，而且活性强。实际上组织样本在保存液中存放一天后解离的效果和活性，包括后期单细胞测序数据所呈现的结果都具有很高的重复性。

产品特征： MACS Tissue Storage Solution是一款经工艺优化后的全新组织保存液，该保存液能有效避免实验过程中的细胞活化、凋亡、坏死等现象，降低实验背景干扰。该产品广泛应用于人和鼠的肿瘤、皮肤、心脏、脾脏、大脑、骨骼肌肉等实验并获得可靠、优质结果。

应用优势： 适用于多个组织或者不连续性组织样本处理过程；更有效保证干细胞功能性和免疫细胞的稳定性。

1.切取约200mg的组织（黄豆粒大小）；

2.将获得的组织用PBS洗掉组织中的血液；

3.将洗后的组织样本放入加满组织保存液的离心管中，将离心管用封口膜密封好，放入合适的泡沫盒中；

4.生物冰袋是否添加及添加数量视天气情况而定，原则是保持样本在低温（0-4℃）状态，且不能冻住，运输时间须在48小时内，然后开展实验；

百奥医药具有丰富单细胞测序经验，已完成大量的组织保存液储存样本的细胞悬液制备实验，并得到高质量的单细胞悬液结果。

1.组织保存液保存24h-48h的穿刺癌组织细胞悬液制备结果

2.组织保存液保存＜24h的穿刺癌组织细胞悬液制备结果

王俊杰、李超   | 文案

一、什么是单细胞测序？

如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。

目前，测序可以回答以下6类问题：

1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；

2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰；

3. RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度；

4. RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰；

5. 染色质的结构：3C、4C、5C等各种C；

6. 其他魔性应用：比如DNA损伤位置、蛋白-蛋白相互作用等。

单细胞测序，就是想办法在单细胞层面去回答以上6类问题。

二、为什么要使用单细胞测序？

如果把这个问题换个姿势来问，那就变成，为什么非用单细胞测序不可？

世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异可大可小。

比如说，受精卵从一个细胞开始分裂，并逐渐形成囊胚，最终发育成个体的时候，细胞与细胞之间的差异会越来越大：有的分化成神经元，有的分化成骨骼肌，各自表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。

又比如在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块周围的细胞，淋巴转移灶的细胞，以及远端转移的细胞，其基因组和转录组等遗传信息，是存在差异的。而这种差异，在临床上，可以决定该肿瘤对某种疗法是否有效。

这就是所谓的 遗传信息的异质性 。

传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息。为了让大家能够更加直观地理解这个问题，我们不妨来看下面这张图：

为了检测某个蛋白质的表达量，我们可以用Western blot和流式细胞术来实现。但是，用Western blot的话，我们并没有办法区分上述的情况：目的蛋白只在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达呢？因为最终电泳跑出来，就是一条差不多强度的带。但如果用流式细胞术这种在单细胞水平对荧光强度加以测定的技术，就能区分上述的情况了。

同样道理，单细胞测序能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。而这将带领整个遗传学领域进入新的次元。

三、如何实现单细胞测序？

目前主要有两种策略来实现单细胞测序。

第一种，也就是目前大多数人所想象的那样，将单个细胞分离出来，并独立构建测序文库，最终进行测序的路线。我们可以通过流式细胞术（含微流体芯片），或者激光捕获显微切割（LCM：激光捕获显微切割技术）来实现。流式细胞术估计大家比较熟悉，就不多讲了，它主要运用于细胞样品。对于组织切片样品来说，主要是通过LCM来获取单细胞，原理可以见下面的示意图。

不过，将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。通常做十几二十来个细胞，就要烧掉很多钱了。然而，这数十个细胞，就足够说明问题了吗？

为了克服这培橡个困难，近年来多采取第二种策略：基于标签（barcode）的单细胞识别。它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库配塌旁，测得数百上千个单细胞的信息。

不过，针对具体的测序类型，给细胞加barcode的方案是有不小的区别的。对于RNA（转录组mRNA）来说，会比较容易理解一些。由于mRNA测序前需要做逆转录，那么我们只需要在poly T引物的5’端加入barcode即可衫升。具体可见下面的示意图（来自文献doi:10.1038/nprot.2016.154）：

首先将单细胞悬液样品和带有barcode的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的barcode了（蓝色部分）。最后，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。

如果测序对象是DNA，比如全基因组，就需要用别的方式来加barcode。目前主要是通过一种经过改造的高效转座酶（transposase）Tn5来实现。

基因转座是指转座子DNA从一个染色体座位“跳跃”到另外一个座位的过程。在这个过程中，有转座酶的参与。单细胞的DNA测序就利用了这个特性，将barcode DNA预先和转座酶Tn5组装好，再通过上述的微流体技术，将细胞和转座复合物包裹在一个油滴之中。随后，转座酶会把barcode插入到基因组DNA之中。这个过程在文献中也被成为tagmentation。

不过，基于Tn5的barcode复杂度（即能有多少独一无二的barcode）还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，上图中红色的barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别（如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode），barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。具体就不展开讲了。总地来说，仅靠Tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。

为了提高复杂度，即一次能够捕获的单细胞数目，目前的解决方案是走组合索引（combinatorial indexing）路线。（见下图，来自文献doi:10.1038/nmeth.4154）

它的主要思路是，通过两步反应，加两次标签。首先，将单细胞悬液放在多孔板中，并用转座酶Tn5给细胞加第一个barcode，这里每个孔中的barcode是不同的。然后，再将样品混合起来，通过流式细胞术，将少量的细胞分选到含有建库PCR引物的多孔板中。而这些引物是带有第二轮barcode的。因此，经过Tn5的转座，和PCR加标签，绝大部分的细胞就能带上独一无二的barcode了。

读到这里，肯定有人发现这个方案存在的问题。举个例子，万一在流式分选时，在第一个孔里分了两个或以上橙色细胞，然后又通过PCR被加上了红色的标签，那这两个单细胞就无法被区分开来了。

确实如此，combinatorial indexing大概会有10%的撞车率（collision rate），即约有10%的机会把两个单细胞被误认为是同一个。这个数值的高低，取决于第一步tagmentation的复杂度（复杂度越高，撞车率越低），以及在分选时，分到每一个孔里的细胞数量（数量越低，撞车率越低）。但是，combinatorial indexing却能一次识别数千个单细胞，将通量提升数十至上百倍。鱼与熊掌，就看实验者的取舍了。

转自《 单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？ - 知乎 (zhihu.com) 》

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单细胞测序（Single-cell sequencing）是一种高通量、高分辨率的分子生物学技术，可以对单个细胞进行基因组、转录组、表观组等方面的测序，从而深入地了解单个细胞的特性。单细胞测序技术已经在生物医学、生态学、农业等领域得到广泛应用。下面将介绍单细胞测序的应用及思路解析。

一、应用

疾病研究：单细胞测序可以帮助研究人员深入了解疾病的发病机制和诊断标志物，并为新药研发提供关键信息。

生物发育研究：单细胞测序可以揭示生物个体从单细胞到多细胞群体的发育过程，以及不同细胞类型之间的相互作用。

生态学研究：单细胞测序可以研究微生物群落的特点和结构，以及它们在生态系统中的作用和相互作用。

农业研究：单细胞测正碰序可以研究作物的基因型和表型，以及不同生长阶段的生长特点和代谢过程。

二、思路解析

单细胞测序的思路可以分为以下几个步骤：

单细胞分离：单细胞测序需要首先将样本中的单个细胞分离出来，可以通过流式细胞分选、微流控芯片等技术实现。

细胞裂解：将单个细胞进行裂解，释放其中的RNA、DNA等分子。

库构建：将RNA、DNA等分子进行逆转录、扩增、建库等处理，构建出单细胞的转录组或基因组文库。

测序：将构建好的文库进行高通蔽帆量测序，产生大量的序列数据。

数据宏清雹分析：对测序数据进行分析，包括数据质量控制、比对、拼接、注释等步骤，得到单个细胞的基因型、表型、代谢过程、信号通路等信息。

总之，单细胞测序技术是一种高效、高分辨率的分子生物学技术，可以帮助研究人员深入了解单个细胞的特性，为生物医学、生态学、农业等领域的研究提供关键信息。