流式细胞仪介绍系列 I —— 光谱流式

好一点小编带来了流式细胞仪介绍系列 I —— 光谱流式，希望能对大家有所帮助，一起来看看吧！

        流式细胞术已成为分子生物学、医学、免疫学、病理学、植物生物学、海洋生物学等多个研究领域对荧光信号进行高速、灵敏分析的有效方法。仪器*商已经开发出具有独立信号检测路径的多路激光355 nm、405 nm、488 nm、561 nm等流式细胞仪FCM。

一系列更亮和光谱多样化的荧光染料，如用于紫色激光器的亮紫色TM染料已经被开发出来。那我们就盘点一下都有那些新兴的流式细胞仪。-光谱流式

传统的流式细胞术是利用二向色镜和带通滤光片对发出的荧光进行分割和滤除，而频谱流式细胞术是一种检测单个细胞发出的荧光信号的新技术。这一新的光谱- FCM改进了光谱相邻的各种FPs包括光转换FPs和多色荧光染料的组合使用，不仅用于免疫系统的研究，而且用于其他研究和临床应用领域。

光谱流式细胞术 是一种基于常规流式细胞术的技术，其中光谱仪和多通道检测器通常为CCD代替了常规系统中的传统反射镜，滤光器和光电倍增管PMT。

流式细胞仪可以快速进行多参数收集并分析单个细胞或颗粒上的数据。

系列

一.光谱流式原理1.1   索尼发布旗舰级全光谱流式细胞分析仪ID7000™ ，以简便操作流程实现超40色分析        日本东京-索尼公司以下简称“索尼”宣布推出旗舰级全光谱流式细胞分析仪ID7000™ ,以精简的操作流程实现同时超40色荧光的多色流式分析。ID7000™搭载索尼创新的全光谱技术，可配备多达7个激光²和188个检测器，允许研究者从混合细胞群体中检测微弱信号和稀有细胞群体，将当今细胞分析技术所能达到的边界大大拓展。

详细参数可参考索尼官网 https://www.sony.com.cn/zh-cn/cms/newscenter/techonology/2019/FY2019-HQ-Technology-

2.html

2.Cytek Northern Lights        介绍:一个新的流式细胞仪系统，改变了科学家期望看到的性能范式，从一个负担得起的三激光系统。Cytek北极光采用了与它的姐姐Cytek极光相同的突破性技术。和Aurora一样，它的光学设计和非混合算法给了科学家们极大的灵活性，使他们能够在不为每个应用重新配置系统的情况下，使用大量新的荧光素组合。

最先进的光学和低噪声电子提供了良好的灵敏度和分辨率。平行激光束剖面，结合独特设计的流体系统，转化为突出的性能在高样品流量。详细参数:https://cytekbio.com/pages/northern-lights#tab-overview

光谱流式小故事

流式细胞术从1参数技术转移到30参数技术已经花费了50年的时间。

原因之一是硬件的复杂性。一个平均的12色流式细胞仪将包含12–14个独立的检测器和40多个光学滤镜。考虑当前的30荧光参数仪器的组件。需要32个独立的检测器加上电源和前置放大器以及大约50到60多个附加的光学组件-这仅在仪器的发射侧。

如此复杂的仪器的庞大的尺寸，复杂性和*成本是巨大的。现在可以购*具有50多个参数但价格约为一百万美元的商用流式细胞仪。问题是为什么许多*商的持续发展方向都集中在传统的多色技术上，而在很大程度上已经过时了？当前的重点是旧的光电倍增管PMT技术，旧的过滤器技术，最糟糕的是，旧的补偿技术并未促进流式细胞仪技术的发展。还有一种替代方法可能会超出这些多色仪器的功能，而成本可能仅为其五分之一。

J. Paul Robinson  团队在2004年国际分析细胞学学会现为细胞学进展学会的大会上首次提出了功能性光谱流式细胞术 15 ；然后， J. Paul Robinson 在同年的光子学出版物中介绍了光谱流式，随后在2007 年向普渡大学授予了专利。当时，该方法的原理是使用连接到色散元件的32通道PMT阵列。硬件组件减少到只有几个光学元件和一个检测器阵列。向全世界，推广这项技术，并写了NIH赠款，以获取发展光谱流式细胞术技术的资金。

 2011年，索尼获得了普渡大学Purdue University的光谱技术专利许可，并致力于开发光谱流式细胞仪。在几年之内，一些出版物证明了> 10色光谱流式细胞术。光谱细胞术随后实现了超过20种颜色的流式细胞术，使用光谱解混具有出色的结果。

确实，光谱流式细胞仪的真正目标是将我们的注意力从信号强度转移到光谱特征作为最重要的参数。长期以来，我们一直将“亮度”视为信号的最重要特征，因此我们忽略了频谱特征的力量。光谱流式细胞仪可以分析无法通过多色流式细胞仪充分分离的荧光染料，这一点非常相关。

第一期介绍先到这里吧，欢迎关注和转发。

流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。

激光强度:除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。液流速度:可通过操作台数字显示监督，调节　气体压力大小以获得稳定的液流速度。测量区光路调节　:这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。

流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能:仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。

常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。微球用树脂材料*，或标有荧光素，或不标记荧光素。所用的鸡血红细胞标准样品*过程昭下:取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血抗凝剂:鸡血=1:4，经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h，最后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。

需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。

1.打开电源，对系统进行预热；

2.打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；

3.在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；

4.利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；

5.选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；

6.样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；

7.因为实验数据已存入计算机硬盘有的机器还备有光盘系统，存贮量更大，因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；

8.将所需结果打印出来。 1光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；2光源不得在短时间内一般要1h左右关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；3液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；4注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；5特别强度每次测量都需要对照组。

流式细胞术Flow Cytometry ，FCM是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。

一.小妖精的成仙之路

二.样本类型

流式细胞仪可检测多种样本:外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、微生物。

三.工作原理

流式细胞仪主要由3部分组成:液流系统、光学系统、电子系统。进行荧光染色后的待测细胞会在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下待测细胞呈单行排列，依次通过检测区域，被荧光染色的细胞在激光束的照射下会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管 PMT 接收。接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

四.流式细胞术的应用

五.操作过程中的注意点

1.上机前处理

小心荧光淬灭

操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。

那如果不得不推迟实验怎么办？可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。






注意染色顺序

在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为:预实验。

做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。

选好染色方案

染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案:预实验。

在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。

做好阴性对照及同型对照试验

细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。

同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。






选择合适的抗体

通用原则是:为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。

对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

2.参数设定

数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。

电压

电压的调节需根据阴性对照管来调节。

阈值

可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。

目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。






补偿

流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

补偿方式:任意两个通道之间都可以调节。

补偿的调节:根据单染对照管来调节。

六.数据分析

流式细胞仪分析细胞的各种参数都是通过光信号来实现的。

光信号包括了散射光信号和荧光信号。散射光信号包括前向角散射FSC，反应细胞的大小和侧向角散射SSC，反应细胞颗粒度。荧光信号可以用来反应细胞的抗原表达等化学特性。

流式图的种类非常多，最常用的是流式直方图和流式散点图。

直方图

流式直方图只能显示一个通道的信息。

横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。

散点图

X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。

FSC和SSC是流式中两个非常基本的参数，FSC的值能代表细胞的大小，细胞的体积越大，其FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度，细胞内细胞器和颗粒度越大，则SSC越大。

分析外周血细胞时，就可以利用FSC和SSC的特性把细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞左图。

右图中可以看到X轴为CD3，Y轴为CD4，四个象限表示:左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-，右上是CD3+CD4+，右下是CD3+CD4-。






等高线和密度图

等高图:类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。

密度图:点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞越少。

流式细胞仪都是检测相对荧光强度的。所以第一，一定要有对照。

有几个常用的方法来分析:

1.先用对照设置好阈值，然后分析各个组超过荧光强度阈值的百分数的变化

2.如果没有明显的阳性，阴性阈值，可以比较整体的荧光强度的均值，中位数等等，具体采用哪个指标，要看实验目的。

产品名称 流式细胞仪 英文名称 Flow Cytometer

国产/进口 进口 产地/品牌 美国贝克曼库尔特有限公司 型号 EPICS® ALTRA™

参考报价

*商 贝克曼库尔特香港有限公司
流式细胞仪 【性能参数】 EPICS® ALTRA™ Flow Cytometer with HyPerSort Cell SortingDATA ManagementFlowCentreTM流式工作中心与建于Windows平台的EXPOTM32软件系统相配合，建立了强大的、多任务操作的工作环境，这一工作环境可用于数据采集、分析以及结果报告。A CHOICE OF Sorters小型、经济的空冷激光允许分选速度提高到10,000个／秒，为大多数应用领域提供了充足的空间，如果您的购*能力允许，或者研究工作需要，HyPerSort 系统将在更高分选速度的前提下提供更高效、精确的分选效果。

DESIGNED Simplicity操作人员可以直接检查或更换光学滤片以便获得更广泛的荧光染料组合，不需要重新进行光路校准。ConFIGURATION OpticsALTRA多光源选择为用户当前及未来的研究工作提供最多的匹配空间。MULTIPLE Lasers光学工作台及工业标准组件允许多激光组合支持应用工作，经济的空冷激光及高功率的水冷激光为使用者提供多种选择，使用者可以极方便地在多光束间进行联合使用或相互切换。QUARTZ FIOW Cells贝克曼库尔特公司在行业中率先设计高灵敏度石英流动室SortSense，这项技术允许使用者在标准及高速分选模式中使用任何参数，包括侧向散射光。INTELLIGENT Soting崭新的ALTRA分选模式使得在保证得率的前提下最终达到99％的纯度，使用AccuSORT模式可以将特定数量的细胞分别选人微孔板中不同的微孔。

标准分选模式与高速分选模式之间可以极方便地切换。Sort LOCKSortLOCK功能真正实现了无需守候分选，监视屏直观地实时显示分选监控状态，确保分选结果的可信度。SPECFICATIONS检测参数前向-LOG，INT及PEAKPMT 1—LOG，INTPMT2-PMT 5-LOG，INT，PEAK两个附加信号通道AUX可以任意附加到PMT2-PMT5；可选GATE AMP功能参数，可指定至任意的PEAK信号1043寸数放大器数据采集27项参数中，12项参数可以同步采集一个前向散射信号二个AUX信号TIME时间参数RATIOPRISM激光器选择空冷激光Cyonicsl5mW，488nm氩离子激光MellesGriot氦氖激光,633nm，10mWOmnichromee氦氖激光,325nm，20mWMellesGriot氦氖激光，544nm，1．5mWCoherent Enterprise II627氩离子激光，UV50mW，488nm180mW可选带LASERPURE 5i空冷操作系统Coherentlnnova 70系列、90系列、300系列激光。

流动室76 µm SortSense石英流动室100，140pmSortSense石英流动室250 µm Biohazard石英流动室51，61，76，100 and 150 µm jet-in-air高速分选系统流动室70µm及76µmHyPerSortSense石英流动室 光束成型器及光电倍增管 光斑大小µm 高x宽µm12x51 15x6012x151 15x8012x70* 15x808x151* 10x806．5x151 8x806 x 112 15x8017x34 40x80*可选件光电倍增管PMT光谱检测范围300-800nm，电压调整0-2000V样品管多种规格的样品管选择:12X7

5.12X7

6.13X100，保证在进行大量样本分选时，避免频繁更换样本管分选标准套提供 分选纯度大于99％，该分选纯度的速度前提为10,000个／秒SortSense与15，000个／秒Jet-in-Air9种分选模式，包括3种ALTRASort分选模式，同步提供大于99％纯度，大于99％回收率及大于98％的生存能力；Enrichment模式，以及AccuSortTM Exact Count模式用于分选矩阵建立及AUTOCLONE。

你需要6种抗体:CD4-标记荧光1CD25-标记荧光2CD127-标记荧光3加上标记了三种对应荧光的同型非特异抗体。先用同型非特异抗体分别染色的细胞调节阴性阈值。

然后再用已知阳性或者是对应荧光相同的珠子的细胞调节机器的光谱代偿。然后检测染色的样本。先在点阵图设好CD4，CD25双阳性，然后再柱状图到处双阳性的看CD127的分布，得到读数 尽量选新鲜血液。

在一些癌症患者的血液中，人们发现了罕见的循环肿瘤细胞circulating tumor cells，CTC。这些细胞被认为以某种方式从恶性肿瘤释放到血液中。

此外，它还可能参与了继发肿瘤形成的转移过程。如此看来，CTC对癌症研究很重要。当然，它也是相当复杂。CTC通常是细胞角蛋白阳性CK+和CD45阴性CD45-，但并非总是如此。在一些癌症中，上皮细胞粘附分子EpCAM存在于CTC表面，而另一些癌症却不是。

CTC比淋巴细胞大，除了一些“小CTC”亚型。即使是来自同一位患者同一次抽血的样本，CTC也可能存在遗传异质性。临床医生希望有一天CTC的液体活检分析能够取代侵入性的实体瘤活检。

很显然，我们还需要深入了解这些复杂的细胞。此外，CTC在血液样本中的出现也有着预后的意义。CTC是癌症中的捣蛋鬼，它们的存在与预后不良有关。

CTC的罕见又使得研究极其困难。在一大堆有些相似的白细胞中，CTC的出现概率大概是百万分之一。即使是病人，常规抽血的样本中也只有10个或以下的CTC。

了解这种高度复杂而又极其罕见的细胞，成为临床研究的目标。流式分析难怪研究人员一直将流式细胞仪作为CTC分析的工具。“流式细胞仪在从异质样本中寻找稀有细胞的能力是独一无二的，”BD生命科学的市场部经理Trent Colville谈道，“针对表面标志物的荧光标记抗体实现了CTC的鉴定。”随着细胞通量的升高以及操作成本的降低，BD的FACSCanto II细胞分析系统及其他流式细胞仪正在解决这种大海捞针的挑战。

多样化的流式检测技术正帮助研究人员揭开这些复杂细胞的奥秘。Alison Allan等人探索了多参数流式细胞仪在这方面的应用，他们使用人乳腺癌的小鼠模型来模拟CTC分析的挑战1。作者发现，利用贝克曼库尔特XL-MCL流式细胞仪的前向散射能力可测定细胞大小，而三个荧光检测通道可测定HLA、CD45和非整倍体DNA内容，这有助于识别小鼠淋巴细胞中的人乳腺癌细胞。作者认为，通过去除CD45阳性的淋巴细胞，可初步富集CTC，增加实验的信息。

为了获得最佳的结果，CTC的样品制备和分析应当轻柔而快速。“CTC是稀有、脆弱，并对时间敏感的，”赛默飞世尔的高级工程师Mike Ward指出。“如果你能减少样品制备步骤，那么你分析CTC的机会将会提高。Attune NxT流式细胞仪的大样品量是个优势，让你不再需要通过离心或其他方式浓缩你的细胞，那样可能会造成细胞损失或伤害。

”富集策略事实上，任何CTC富集策略都需要将有CTC特征的细胞与没有这些特征的细胞分离，也存在CTC丢失的风险。为了减少这种风险，Tsvetana Hristozova等人开发出一种新的流式分析操作，以检测上皮癌CTC 2。他们以电子阈值操作来取代CD45+ 淋巴细胞的去除。

研究人员对BD的FACSCanto II流式细胞仪进行设置，以检测加在血液样本中的UT-SCC-23鳞状细胞癌细胞，同时滤除细胞碎片引起的低前向散射信号，以及产生非CTC荧光图谱的细胞。结果表明，在数据采集过程中应用的电子阈值确实能省去CTC分析前的肿瘤细胞预富集。之后，他们将这种方法应用在头颈部鳞状细胞癌SCCHN患者的真实血液样本中，发现电子阈值操作检测到的CTC频率和数量与传统的免疫去除方法相当。

作者的结论是，两种方法在分析SCCHN的CTC上同样有用，但阈值法更加经济，也更加省力。在去年的美国癌症研究协会年会上，Amnis公司默克密理博旗下的科学家介绍了一种新方法。它利用多光谱成像以及Her-2和EpCAM的SmartFlare探针，这些靶定细胞内的RNA序列，而不是细胞表面蛋白。他们利用Amnis ImageStream MK II成像流式细胞仪来检测散发Her-2和EpCAM荧光信号的SKBR-3人乳腺癌细胞。

在白细胞过量10万倍的情况下，癌细胞的进一步鉴定是通过细胞大小和圆度分析来实现的。研究数据表明，这种成像流式细胞仪能够检测到十万分之一的肿瘤细胞。作者指出，在临床环境中，流式细胞仪所获得的细胞图像的分析可避免假阳性的发生。

流式细胞仪用于CTC分析的优点可不少。细胞的高速流动让研究人员能克服百万分之一的CTC发生率。样品运行的成本相对较低，而且市场上有各种荧光染料和仪器可以选择，让研究人员能自由地开展实验设计。不过，流式细胞仪是否会成为液体活检的主要平台，这还难以预测。

当然，随着人们不断开发出更先进的试剂和仪器，能够快速、详细地拷问流动的细胞，流式细胞仪在CTC分析上的优势将日益明显。

每一种激光，都可以激发一定数量的荧光素。而每一种荧光素，都可以被一定波长范围的光所激发。

机器在配置的时候，或考虑到成本和使用目的。双激光的成本要大大低于三激光。一般一个激光就可以检测4色，双激光检测8色已经是极限了，而且很可能是488和647这两个波长的激光。而三色一般是增加了405 或者561nm的激光，增加了可激发的荧光素的种类。同时也减少了可能的光谱重叠机会。

所以肯定在性能上是优于前一种配置的，而且以后还有升级的可能。

制备单细胞悬液，使用不同颜色的荧光标记的抗体，如CD3-FITC，CD19-APC等。将细胞和抗体孵育，不同种类的细胞表面表达的抗原不同，因此会标记不同颜色的抗体，然后到流式细胞仪检测荧光信号。

这是大概的过程和原理。但流式细胞仪每天使用前要校准，这样检测出来的数据才准确。

“通道”这个称呼一般只用于特定的机器，大多数的流式细胞仪上来来说，是要看光谱来匹配所要使用的检测头.该荧光染料的光谱如下从图中可以看出，最大激活在350nm波长，所以要使用紫外激光。而最强释放波长在450nm左右。

在选机器的检测器的时候，首先要选是针对紫外激光器的探头，然后看探头前方滤镜的通过波长，一般是450/50这样的。和DAPI通用。

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