质粒小量提取试剂盒常见问题与解析

好一点小编带来了质粒小量提取试剂盒常见问题与解析，希望能对大家有所帮助，一起来看看吧！

质粒小量提取试剂盒常见从1～4mL菌液可以抽提到5～30µg的质粒，纯度高，OD260/OD280比值一般为1.8-2.0之间，质粒可直接用于PCR、酶切、转化测序和体外转录等后续实验。那么在实验过程中常见问题有哪些，下面跟我一起来看一下。
质粒小量提取试剂盒质粒得率低可能原因及解决办法：

1、菌体未活化，生长效率低，菌量少。需要活化菌种。

2、属于低拷贝质粒，增加菌液的量。

3、SolutionB裂解不充分，室温静置5min。

4、最后洗脱体积不够，洗脱液不少于50µL。

质粒小量提取试剂盒质粒纯度差可能原因：

1、SolutionA未加入RNaseA或加入RNaseA的SolutionA 未4℃保存。

2、加入SolutionB剧烈震荡，使得基因组断裂。

3、加入BufferN操作慢，形成微小沉淀，蛋白质无法被充分漂洗干净。

4、BufferW2未加入无水乙醇。

5、OD260/OD280比值一般在1.8-2.0之间，小于1.8可能有蛋白污染，大于2.0有部分降解或RNA污染。

质粒提取试剂盒是采用碱裂解法裂解细胞，通过吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。提取的质粒DNA可适用于各种常规的分子生物学试验，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。并不是医疗器械。

p1：葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca²⁺和Mg²⁺等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。

p2：此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。

p3：溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 ，而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

2M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。

扩展资料

质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒为DNA重组技术中常用的载体。载体，把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。

将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞（如大肠杆菌）中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。

参考资料来源：百度百科-质粒

参考资料来源：百度百科-质粒抽提

质粒提取试剂盒一般包括：质粒小量提取试剂盒（离心柱型）、质粒大量提取试剂盒（离心柱型）、无内毒素质粒小量提取试剂盒（离心柱型）、96板高纯质粒DNA小提试剂盒。
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