elisa试剂盒实验原理

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上海科艾博生物（COIBO）科技
从大的方面说ELISA属于酶免疫技术。 免疫酶技术是将酶作为标记物，标记抗体或抗原后，与相应的抗原或抗体发生反应，通过标记酶相应底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量的检测依据。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），如果要分类的话，它属于异相固相酶免疫技术。所谓异相是指在检测时不需要将酶标记抗原抗体和游离抗原抗体分开，所谓固相就是指的ELISA的96孔板固相载体了。看下面均相酶免疫测定的原理图：
ELISA的主要原理很简单，有这么三个，

1、包被 抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，可能原理是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗体反应等免疫活性；

2、标记 抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点；

3、显色 酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或者抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。ELISA 实验设计根据检测对象的不同，我分别给童鞋们介绍抗原的检测方法设计和抗体的检测方法设计。抗原的检测设计

1、双抗夹心法 针对至少2个抗原决定簇的多价抗原。首先介绍一下抗原决定簇，抗原决定簇就是决定抗原性的特殊化学基团，也叫抗原表位，理论上一个抗原决定簇能诱导产生一种单克隆抗体（可能有童鞋又要问单克隆抗体是神马东东了，以后介绍啊）。由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（线性表位）组成或由不连续的蛋白质三维结构（构象表位）组成。临床上具有2个抗原决定簇的多价抗原有很多，比较常见有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。检测步骤也简单，就是包被、洗涤、加样、洗涤、加样、洗涤、显色。具体说来是先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，再加入待测样品，若其中含有待测抗原就会与固相抗体结合，洗掉杂质后，再加入酶标记的检测抗体进行反应，洗掉多于的酶标抗体后，加入底物显色，显色与否以及颜色的深浅就代表了待测抗原是否存在以及相对含量了，简单吧。
对于双抗夹心法检测大分子抗原要注意几点，1.固相抗体和酶标检测抗体一定是分别针对待测抗原的两个不同抗原决定簇，不然两个抗体就会为争同一个决定簇而打架，会出现假阴性的不良结果；2.如果检测的样本是血清，就要注意风湿病患者体内内风湿因子RF这种奇葩异种抗体的存在，它能够神奇地结合固相抗体和检测抗体，造成假阳性的不良结果；3.包被的固相抗体含量一定是高于样品中的抗原含量，不然检测到的含量会比实际含量低；4.如果有童鞋想高端省事一些，将待测样品与酶标检测抗体同时加入固相载体，在酶标检测抗体高于样品中的待测抗原的情况下，会出现假阴性结果，这种现象书本叫钩状效应。

2、竞争法 针对小分子抗原。这种方法也可以用于大分子抗原，只是相对双抗夹心法这种强悍的策略，竞争法完全没有优势，所以竞争法只在检测小分子这个边缘地带发挥余热了。临床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及药物等。检测步骤与双抗夹心法更简单，包被、洗涤、加样、洗涤、显色，少了一步加样的过程，但是设计上复杂一些，首先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，然后每组样本需要分两组，一组同时加入事先混匀好的酶标检测抗原和样本的混合物，一组只加入酶标记抗原，两组颜色只差便是待测抗原的含量，有点晕啊。
对于竞争法也需要注意一点，酶标记抗原和待测样本一定要事先混匀好，然后同时加入固相载体，不然会造成不公平竞争，检测出现偏差；抗体的检测设计

就方法来说，有间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法四种设计。

1、 间接法，这个是检测抗体最常用也最简单的方法。操作步骤与双抗夹心一样，只是包被是纯化的相应抗原而不是抗体了，加入样品后洗涤，再加入的酶标记抗抗体，然后显色，颜色深浅与样品中待测抗体的浓度正相关。这个间接法的原理和步骤与双抗夹心一样一样的，为了区分就把包被抗原检测抗体叫做间接法了，以此类推，之前的双抗夹心法也可以叫做直接法，命名其实就是这么回事，规则多了就容易让人糊涂。间接法也有一些自己的特点，1.酶标记抗抗体可选择性检测抗体的亚型，可用于鉴别感染时期，如果是IgM那么提示感染早期；2.酶标抗抗体检测抗体特异性不高，容易产生假阳性，如果封闭不完全，可出现全板阳性，挺吓人的。临床上常用该方法检测抗HCV抗体、抗HEV抗体、抗CMV抗体、抗HSV抗体、抗沙眼衣原体抗体等等。
2、 双抗原夹心法，这个完全是山寨双抗夹心法的。原理和步骤也与双抗夹心一样一样的，与间接法相比，具有优越的灵敏度和特异性，但不是很常用，因为就目前的技术条件，想得到能用于ELISA检测的纯化抗原还是有一定的难度。临床上常用于检测HIV抗体初筛，TP抗体和抗HBs抗体等，这些检测对特异性和灵敏度，准确性都要求特别高。
3、 竞争法，和检测抗原设计的竞争法完全一致，临床上用的不多，我仔细总结了一下两个很具有代表性的，也各具特点。1、抗HBc抗体，检测方法与抗原相同，包被抗原之后，分两组，一组加入预先混匀的酶标抗体和待测样品，一组只加入酶标抗体，两组的显色之差可代表待测抗体的相对含量，需注意的是待测抗体与酶标抗体是同一物质；2、抗HBe抗体检测，方法与抗原竞争法设计稍有区别，包被的抗HBe抗体后，检测也分两组，一组先加入酶标HBeAg再立即加入待测样品，一组只加酶标HBeAg，两组显色之差代表待测抗体的相对含量，这种设计中包被抗体和待测抗体是同一物质。值得注意的是混合组不是事先混匀再加入，而是先加入待测抗体后再加入酶标抗原。所有的这些复杂的注意事项确实很容易把人搞晕，但是童鞋们只需要记住一条，竞争很残酷，我们就要想尽一切办法保证竞争的公平性，这样就不会错。
4、 捕获法，这种方法比较少用，由于具有识别抗体类型的优点，仅用于需要早期诊断的急性感染或者具有爆发性感染的疾病，如HAV-IgM、HBc-IgM、ToRCH等等。原理还是逃不脱经典的双抗夹心，具体方法是先包被能识别抗体类别的抗抗体，洗涤后加样品，再洗涤，加酶标记抗原，洗涤后显色，这些步骤闭上眼睛都能写出来。
最后说两句，与抗原检测不同，抗体检测的设计不是根据抗体的结构特点了，这么多种设计方法，童鞋们用的时候就会选择障碍了，掌握2个原则，1.实验要求，如果需要特异性和准确性特别高，那肯定是双抗原夹心法，要求马马虎虎，那就间接法，如果要明确抗体类型，最好的选择就是捕获法了；2.实验成本，与纯化抗体不一样，有时候想要获得纯化的抗原是非常困难的，更别说两种不同的纯化抗原了，所以双抗原夹心法临床上用的并不多。ABS-ELISA顺便说一下ABS-ELISA设计，其实是和上面说的一样的，通过亲和素-生物素系统（ABS）方法显色反应，增加检测灵敏度而已，但是增加操作步骤与实验成本，而且现在单克隆抗体的技术越见成熟，抗体特异性和亲和力大大提高，灵敏度已经不是问题，所以这些次等装备已经不常用。
结果判定最后和童鞋说说ELISA结果判定，分定性和定量两种。对于定性试验，参比阴、阳性对照的吸光度，以P/N或者S/CO比值形式报告。1. P/N比值是指（待测样本-空白对照）/（阴性样本-空白对照），一般以P/N≥2.1判为阳性，或许求知欲旺盛的童鞋会问，那么竞争法用P/N比值怎么判，呵呵，这里先不说，*个乖，你可以百度或者私信我啊；2. S/CO比值，S是待测样本吸光度值，CO为CUT-OFF值，通常取值阴性对照平均值的2.1倍。S/CO比值≥1为阳性，竞争法S/CO比值≤1为阳性。定量检测没有什么可说的，老老实实做标准曲线，既锻炼实验操作能力，又可作为实验内部参照。

记得有这么个规定，定性检测不能目测判断，要凭借酶标仪检测，定量要在每次实验都得与待测样本相同实验条件下绘制标准曲线，有一难度，但是为了对实验负责，你就从了吧。

通过酶联免疫吸附反应进行实验
来检测特定物质的试剂盒
试剂盒中会有不同浓度的标准样品
在酶标条中
通过固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物反应
可形成标准曲线
从而进行试验样品的测定
检测不同的物质有对应不同的试剂盒

ELISA试剂盒的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。ELISA试剂盒用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA试剂盒可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

1、细胞因子检测试剂盒：
如白介素、选择素、集落*因子，肿瘤坏死因子，干扰素，转化生长因子，趋化因子，细胞因子受体，粘附分子，生长因子，凋亡因子等等
2、心肌梗塞检测试剂盒：
如肌钙蛋白，肌红蛋白，C-反应蛋白等等
3、内分泌检测试剂盒：
如甲状腺,胰腺,性激素,孕酮,睾酮,生长激素,生长抑素,内皮素,皮质醇,骨钙素,催乳素,促肾上腺皮质激素,促卵泡素,雌二醇，雌三醇等等
4、肝纤维化检测试剂盒：
如纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白等等
5、自身免疫检测试剂盒：
如甲状腺,抗核抗体,类风湿因子,循环免疫复合物,抗胰岛细胞抗体等等
6、肿瘤标志物检测试剂盒：
如肿瘤标志物，组织多肽抗原，肿瘤相关因子等等
7、优生优育检测试剂盒：
8、传染病检测试剂盒
如百日咳,EB病毒,A族链球菌等等
9、特种蛋白检测试剂盒
如免疫球蛋白,抗链O-aso,类风湿因子RF,C反应蛋白,微量白蛋白,β-2微球蛋白human,铁蛋白,转铁蛋白transferrin等

专业名称为酶联免疫试剂盒，做测试专用 重复性好的实验诊断方法。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应 试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观http://www.021elisa.com/去看看

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